荧光成像 失败原因与成功诀窍
荧光显微镜的使用需要很多专业技术，若要全部掌握需要花费大量的时间。但是，只要掌握观察时的基本拍摄方法及基础性的要点，即使不熟悉荧光显微镜原理，也能够获得准确的实验数据。下面，基于荧光成像中容易陷入失败的案例，总结在短时间内高效拍摄的要点。
何谓荧光成像
荧光成像（Fluorescence imaging）是指，对无法直接观察的无色透明的细胞器官或特定蛋白质，通过荧光标记试剂或荧光抗体进行荧光标记从而实现可视化的手法，由此能够对细胞或蛋白质的形态或结构、生命活动进行观察与分析。
荧光试剂或抗体经过特定波长光（激发光）的照射后具有发光特性，通过荧光显微镜或激光共焦显微镜进行观察。
从可进行活细胞的实时观察到分子级别或细胞级别各种各样的实验，大量的生物实验均基于荧光显微镜的使用。另一方面，使用荧光显微镜进行分析或评价的结果会因选择的相机、物镜以及光源等的不同而产生差异。
荧光成像失败事例1：对焦失败
对焦是显微镜的重要的基本操作。通过观察准确的焦平面图像才能进行准确的实验评价，图像（Figure）的品质有时甚至左右论文能否受到认可。首先，说明拍摄对焦准确的清晰图像拍摄的要点。
要点1：确认使用的物镜是否合适
要进行显微镜观察必须了解观察目的与物镜特性是否相符。尤其在荧光观察中重要的是数值孔径（NA），数值孔径越大，越能获取明亮，正常情况下，数值孔径越大分辨率也越高，可获取精细的图像，但在另一方面，景深（Depth of Field：DOF）则变浅，被摄物体的可视对焦范围变窄。除此以外，物镜亮度或观察距离也需要考虑，这些特性间的相关关系如下图所示。
一般物镜特性
| 分辨率 | NA | 观察距离 | 景深 | 亮度 |
|---|---|---|---|---|
| 高 | 大 | 短 | 浅 | 亮 |
| 低 | 小 | 长 | 深 | 暗 |
另外还有需要盖板玻璃校正*1及校正环调整*2的物镜、专用于特殊观察方法的光学设计物镜等各种各具特点的物镜*3。根据观察方法选择合适的物镜尤为重要。
*1 盖板玻璃校正：
盖板玻璃校正物镜设有盖板玻璃校正值。正常情况下，盖板玻璃使用0.17 mm，塑料培养皿为1.2 mm，不使用盖板玻璃时使用0 mm物镜。
*2 校正环调整：
高倍率物镜中还有外壳部分带有校正环（类似表盘）的部件。根据盖板玻璃的厚度调整校正环，分辨率可变化数倍，使用前请务必确认校正环的状态。
*3 物镜的特点：
按照观察方法，有时需要符合观察方法的特定光学设计物镜。包括相差、微分干涉、偏光、荧光、油镜等。请确认物镜种类。
要点2：从低倍率向高倍率调整物镜
要点3：由近及远查找焦点位置
荧光成像失败事例2：荧光信号过暗，对比度不足
在荧光成像中重要的是获取目标荧光分子或荧光蛋白质的信号清晰可见的图像。为此，重要的不仅是物镜，还有与相机或滤光片、光源等各种单元的组合，如果组合构成失败，会使图像的荧光信号过暗、对比度过低，从而难以观察。下面，说明获取清晰图像所需掌握的要点。
要点1：使用适合观察的相机
相机也有很多种类，下面介绍广泛用于荧光显微镜的CCD相机的特点。
荧光观察中重要的是S/N比（信号与干扰的比率）足够高，因此在下表中合适的是黑白制冷CCD相机。
| 彩色 | 黑白 | |
|---|---|---|
| 非制冷 |
|
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| 制冷 |
|
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*1 可见光：
一般是指波长大约为400至700 nm的光。彩色相机的显示与人眼相同，会切断波长长度700 nm以上的光。因此无法观察。
*2 暗电流和制冷：
CCD相机内部在没有输入光的状态下也会产生叫作“暗电流”的信号，是造成干扰的原因。曝光时间越长受光元件的温度越高，干扰也变大，通过冷却相机可抑制干扰。
要点2：使用调节亮度功能
亮度调节功能有多种，在相机设定中主要的调节方式是以下3个项目。理解这些特点并熟练地区分使用对荧光成像非常重要。
- 曝光时间
- 快门处于开启的时间。为在此期间积蓄信号，曝光时间越长亮度越高，同时暗电流干扰也会累积从而干扰增多。
- 增益
- 对输入CCD元件的电信号进行电性放大。但是，放大输入信号后，干扰也会同时被放大。分辨率不因增益值而变化。
- Binning（像素融合）
- 将临近的像素视为1个假想像素，提高每个单位像素的接收信号量的功能。由于像素被合并图片整体的像素数减少，分辨率将下降，但不会增加干扰。
要点3：荧光滤光片与试剂的匹配
即使荧光信号明亮而发光，如果滤光片透过率过低，仍无法充分观察信号。重要的是尽量使用透过率高的滤光片。
荧光滤光片由激发滤光片与吸收滤光片、二向色镜共3部分组成。确认激发滤光片是否与试剂的激发光谱重叠，吸收滤光片是否与试剂的荧光光谱重叠。假设加入滤光片上标注470/40时，表示可涵盖470nm±20nm的波长范围。数值数据难以理解时，观察试剂与滤光片的光谱数据来判断是否匹配。各种试剂或滤光片的光谱数据可通过各厂商的网站等确认。
要点4：物镜的选择
荧光信号偏弱，或对比度不足时，可通过更换NA值更大的物镜，以便更明亮地观察。 NA值越大，越能够明亮地观察荧光信号。物镜的倍率越高，NA值也趋于变大，S/N比的上升不够理想时，通过使用倍率更高的物镜也可解决问题。
要点5：光源的选择
有些光源没有发出要观察的波长。需要确认使用的光源，了解光源的特点并区分使用。
相比于水银灯或金卤灯是1种光源包含短波长到长波长的大范围波长，激光或LED是1种光源只发出特定范围的波长，因此需要将多个光源组合使用。信号无法顺利发光时，确认试剂与光源波长的光谱数据。
荧光成像失败事例3：荧光发生淬灭，细胞活性下降
发生淬灭或细胞活性下降的原因大多在于激发光导致的损伤。即使是瞬间，只要照射强烈的激发光，就会出现淬灭现象，细胞也会因光毒性影响而导致活性下降。为了防止此类现象，首先需要尽量“降低激发光强度”。但是，即使降低了激发光的强度，若长时间照射激发光，荧光信号仍会衰减直至淬灭，细胞将逐渐累积损伤最终失去活性。因此，降低激发光强度的同时，“缩短激发光照射时间”是防止激发光对实验影响的重要两点。
要点1：激发光强度下降
降低激发光强度，荧光就会相应地变暗，因此需要提高相机增益或延长曝光时间。但是，提高增益或延长曝光时间，就会增大暗电流的干扰，S/N比变低。
要在抑制淬灭及损伤的同时拍摄S/N比高的图像，需要尽量使用灵敏度高的相机。
要点2：缩短激发光照射时间
要缩短激发光照射时间，需要降低基本的操作时间，因此尽量缩短对焦时间、信号查找所用的时间、设定曝光时间所用的时间等操作所用的时间。
另外，对于手动控制激发光快门开闭的显微镜类型，可能发生忘记关快门而造成长时间持续照射激发光，导致淬灭。因此拍摄结束后或临时停止观察时，及时关闭快门尤为重要。
